¿Qué es la histopatología?
La histopatología es la ciencia que abarca el estudio de las modificaciones patológicas de los tejidos del cuerpo. Para los cual se utiliza el examen microscópico de muestras obtenidas por biopsias, necropsia u otros procedimientos.
Una vez se cuenta con el material a evaluar se indagan una serie de características, como establecer el origen de la muestra, determinación de la existencia de lesión, tipo de lesión, patrón histopatológico, extensión y gravedad de la lesión, además de las características citológicas. Para el cual se emplea la histotecnia.
¿Qué es la histotecnia?
La Histotecnia o técnicas histológicas constituyen el conjunto de procedimientos especiales a que se somete el material o muestra obtenidas por biopsia o necropsia, en estudio con la finalidad de prepararlo y conferiré las condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus estructuras morfológicas a través de un microscopio.
¿Cómo obtener las muestras?
Las muestras para el análisis histopatológico deben ser obtenidas por dos métodos; biopsia (escisional y incisional) y necropsia.
¿Qué tipos de biopsia existen para la extracción de muestras?
Las biopsias son la extracción y examen microscópicos de material histológico y citológico procedente de un organismo vivo. Dicho material se obtiene de órganos, cavidades, tejidos, sangre o secreciones, con el fin de diagnosticar el estado patológico de la misma. Pueden ser:
Biopsia escisional o quirúrgica: Consiste en la extracción completa de una lesión o órgano. Por ejemplo, lesiones nodulares cutáneas, ganglios y órganos completos como ser el bazo.
Biopsia incisional: Se realiza la extirpación parcial de un tejido u órgano, es realizada con herramientas como: punch, sección directa con bisturí, biopsia con aguja de jamshidi, biopsia endoscópica, etc.
Tras la extracción se debe elaborar un informe con datos del paciente (historia clínica) para ofrecer un buen diagnóstico
Muestras obtenidas por necropsia.
La necropsia o autopsia es el estudio de órganos y tejidos de cadáveres de animales. Su finalidad suele ser el diagnóstico de la causa de muerte, pero también puede hacerse con fines de investigación.
Todas las necropsias pueden ser:
- Completas: abarcan las tres cavidades craneal, torácica, abdominal.
- Parciales: solo en una cavidad. Referente al lugar de sospecha de la alteración que produjo la muerte.
Procedimiento de obtención de muestras para biopsias
- El estudio histopatológico de una muestra de tejido sólo debe ser solicitada por un Médico Veterinario.
- El Médico Veterinario que solicite el estudio deberá llenar una ficha con los siguientes datos:
- Identificación del Médico Veterinario: nombre, dirección de consulta o clínica, teléfono y/o correo electrónico.
- Identificación del propietario: particular.
- Identificación del paciente: nombre, especie, edad, sexo, raza.
- Anamnesis: Antecedentes clínicos, pre diagnóstico, cirugía realizada, órgano o tejido enviado.
- Fecha de la solicitud.
- Las muestras de tejido para biopsias se depositarán y mantendrán en frascos de diferentes tamaños con el fijador seleccionado, que cumplan con los siguientes requisitos:
- Transparentes.
- Plásticos, no está permitido frascos de vidrio por riesgo accidente corto punzante.
- Tapa rosca, boca ancha.
- La muestra deberá colocarse en el frasco con una cantidad del fijador (formol u otros) que cubra todas las caras.
- Si el tejido muestreado presenta una cápsula gruesa se sugiere realizar un corte en la superficie de esta, para la mejor penetración del fijador.
- Si las muestras miden más de 5 centímetros, se debe realizar cortes cada 1 cm sin destruir las morfología de las muestras (esto facilita la penetración del fijador)
- Identificación de la muestra: se realiza en el cuerpo del frasco NO EN LA TAPA.
- Nombre del paciente
- Fecha
- Tejido
- Médico Veterinario solicitante
- Traslado de la muestra Todas las muestras deben ir acompañadas de su respectiva orden de solicitud de estudio histopatológico con los datos antes mencionados. Las órdenes de biopsias deben ir en la misma caja de las muestras y dentro de bolsas plásticas por eventual derrame. Los frascos deben ser embalados con protección anti derrame.
- Criterios de rechazo de muestra
- Muestra sin solicitud
- Mal rotulación de la muestra
- Muestras no fijadas o en proceso de autolisis
- Fijador no adecuado o en proporciones insuficientes.
Fijación para la remisión de las muestras
Al realizar la extracción de un órgano o tejido provocamos la muerte de las células. Para evitar la autodigestión celular, debida a la actuación de enzimas lisosomicas, es necesario introducir el material rápidamente en un líquido fijador que paralice el proceso de autodestrucción.
La fijación se puede realizar mediante procedimientos físicos (congelación) o procedimientos químicos, los utilizados generalmente (formol neutro o tamponado al 10-15%). La fijación debe iniciarse lo más pronto posible para evitar la autolisis.
Para tener una buena fijación se debe tener bloques de tejidos a fijar que no exceda de 1*1 cm. El volumen del fijador deberá ser diez a veinte veces mayor que el volumen de la muestra. El tiempo de fijación dependerá del fijador químico y del tamaño de la muestra.
¿Cómo realizar la dilución del fijador?
La solución saturada de formol puro o al 40%, se diluye en agua destilada al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada). Lo ideal seria tamponarse para evitar la oxidación. Ejemplo: 100 ml de formol en 900 ml de agua destilada.
¿Qué tiempo es el adecuado para fijar las muestras de biopsias?
La fijación debe iniciarse en los primeros 30 minutos tras la extracción, de manera inmediata si es posible.
Histopatología para el diagnóstico de patologías.
La histopatología es una ciencia que nos permite observar u diagnosticar las posibles alteraciones patologías de los tejidos que pueden ser extraídos por medio de biopsias o necropsia. Para ello la histopatología nos permite diagnosticar las siguientes patologías de acuerdo a su medio de extracción.
A. Biopsias.
Biopsias cutáneas:
- Neoplasias
- Infecciones (foliculitis, celulitis).
- Procesos inmunomediados.
- Trastornos de tipo endocrino
- Defectos de queratinización.
- Alergias.
Biopsias de órganos internos
- Neoplasias
- Intoxicaciones
- Procesos infecciosos
- Degeneraciones
B. Necropsias (causas de muerte del animal)
- Procesos infecciosos
- Intoxicaciones
- Problemas inmunológicos
- Problemas endocrinos.
Consideraciones histopatológicas para el diagnóstico de neoplasias extraídas por biopsias.
El estudio histopatológico es la clave para el diagnóstico oncológico o de neoplasias en los animales, para ello el paso más importante es obtener e interpretar la biopsia, que nos responderá a las siguientes interrogantes:
a). Tipo específico de neoplasias
b). Grado Histológico: por lo general existen los siguientes; bien diferenciado (Grado I), Intermedio (Grado II), Indiferenciados o anaplásicos (Grado III).
La clasificación de los grados se basara de acuerdo a:
- semejanza en las características celulares
- índice mitótico
- características del estroma y porcentaje de necrosis tisular.
- Evidencia de invasión o metástasis.
d). Márgenes histológicos: presencia de células tumorales en el tejido alrededor de tumor extirpado.
Tipos de neoplasias más comunes en caninos y felinos
CLASIFICACION DE LAS NEOPLASIAS | CATEGORIA | NOMBRE DE LAS NEOPLASIAS |
Epiteliales | Benignas | Tricoblastoma |
Tricoepitelioma | ||
Adenoma sebáceo | ||
Papilomas | ||
Malignos | Carcinoma de células escamosas | |
Carcinoma sebáceo | ||
Carcinoma basocelular | ||
Mesenquimatosas |
Benignos | Fibroma |
Lipoma | ||
Condroma | ||
Osteoma | ||
Hemangioma | ||
Linfangiona | ||
Malignos o sarcomas de tejidos blandos | Fibrosarcoma | |
Liposarcoma | ||
Condrosarcoma | ||
Osteosarcoma | ||
Hemangiosarcoma | ||
Hemangiopericitoma | ||
Linfangiosarcoma | ||
De células redondas |
| Mastocitoma |
TVT | ||
Histiocitoma | ||
Plasmocitoma | ||
Linfoma | ||
Melanociticos |
| Melanoma |
Procedimiento y métodos empleados en el proceso de las muestras remitidas al laboratorio.
La recepción consiste en recibir la muestra de procedencia de clínicas veterinarias o instituciones ajenas que requieren los servicios de diagnósticos de histopatología, aquí se revisa si la muestra está en condiciones aptas para ser procesada histológicamente, si cuenta con las condicione adecuadas se procederá al registro de muestras en inventario, para darle una identificación.
2.- Identificación y descripción o evaluación macroscópica de las muestras
En la identificación en el laboratorio se la realiza por códigos que van de acuerdo al año y el orden de llegada de la muestra (p.ej. 230138 y 230139.), una vez identificado el número de laboratorio, se identifica al propietario y seguido la especie de la cual corresponde la muestra extraída.
La descripción macroscópica de las muestras para identificar las características y condiciones en que llega la muestra y encontrar algunas alteraciones en tamaño, forma, erosiones ulceraciones.
- Identificación en laboratorio
- Identificación en laboratorio
- Examen macroscópico
- Examen macroscópico
- Cortes cada 1-2 cm en órganos o muestras de gran tamaño
3.- Procesamiento histológico de las muestras de más muestras
En proceso histológico de muestras que llegan se aplica las siguientes técnicas para tener el material de muestras en láminas para un diagnostico histopatológico.
- Fijación con formol bufferado al 10%.
- Entrada de muestras
- Deshidratación
- Aclaración
- Inclusión en parafina y formación del taco
- Corte histológico
- Extensión del corte del tejido
- Desparafinación
- Hidratación
- Coloración con hematoxilina- eosina
- Deshidratación
- Montaje
Fijación
La fijación es realizada con formol bufferado al 10%. De 24 – 48 horas
– Entrada de muestra
Transcurrido el tiempo de fijación se somete la muestra fijada a cortes que oscilen entre los 3-5 mm de grosor para que sea sometida a deshidratación
– Deshidratación
La deshidratación tiene como fin remover toda el agua que se pueda extraer de los tejidos, y reemplazarla con un medio que solidifique, para que de esta manera facilite el corte de dichos tejidos. Se realiza en alcoholes de menor a mayor grado.
Protocolo de deshidratación en el laboratorio de patología
Alcohol 70% | 15 min |
Alcohol 70% | 15 min |
Alcohol 80 % | 30 min |
Alcohol 80% | 30 min |
Alcohol 95% | 1hora |
Alcohol 95% | 1 hora |
Deshidratante 100% | 1hora 30 min |
Deshidratante 100% | 1 hora 30 min |
Sustituto de Xilol | 1 hora |
Sustituto de Xilol | 1 hora |
- Inclusión en parafina y formación del bloque
El proceso de infiltración o inclusión en parafina se realiza en estufas de inclusión y a una temperatura de fusión de la parafina (60ºC), que se utilice. El periodo de inclusión deberá tomar entre 2-6 horas. Se hace un bloque de parafina fundida. Se introduce y orienta la muestra, con ayuda de una pinza templada. Se deja solidificar a temperatura ambiente y se etiqueta el bloque.
- Obtención de los cortes
Para la confección del corte se requieren aparatos llamados micrótomos, que constan de porta bloques, un sistema de avance mecánico, para regular el espesor de cada corte y un soporte para la cuchilla de acero. Los cortes son realizados de 5 a 7 micras.
- Extensión de los cortes
Los cortes se extienden introduciéndolos en un cristalizador con agua a 30 – 40ºC, para eliminar arrugas y aire atrapado por debajo.
- Adhesión de los cortes al portaobjetos
Extendido el tejido en el cristalizador con agua se levanta en un portaobjeto, con sumo cuidado para evitar arrugas de la muestra. Que se dejan posteriormente secar en una estufa a una temperatura de 37ºC o temperatura ambiente.
- Desparafinar
Para proceder a la coloración de la muestra el primer paso es la desparafinación, eliminando la parafina, ya que los colorantes son soluciones acuosas y como se ha descrito la parafina es insoluble en agua. Para la desparafinación se utilizan disolventes orgánicos tipo xileno o xilol.
- Hidratación
Se procede a la hidratación del corte en soluciones decrecientes de etanol de 100º a 70 º por ciento.
- Tinción o coloración
La coloración más habitual es la hematoxilina – eosina (HE). La hematoxilina que coloreara estructuras acidas de las células y tejidos, dichas estructuras son denominadas basófilas, colorea el núcleo celular o cúmulos nucleícos como ribosomas. La eosina que colorea estructuras eosinófilos o acidófilas, colorean el citoplasma celular o algunos orgánulos como mitocondrias.
Protocolo de coloración Hematoxilina – Eosina en el laboratorio de patología
Sustituto de Xilol | 5min |
Sustituto de Xilol | 5min |
Deshidratante 100 % | 3min |
Deshidratante 100 % | 3min |
Alcohol 95% | 3 seg (pasos rápidos) |
Alcohol 80% | 3 seg (pasos rápidos) |
Alcohol 70% | 3 seg(pasos rápidos) |
Agua | (enjuague) |
Hematoxilina | 3 min |
Agua | (enjuague) |
Alcohol acido al 3% | (pasos rápidos) |
Agua | Enjuague |
Carbonato de litio | pasos rápidos |
Agua | Enjuague |
Eosina | 5-7 min |
Alcohol 70% | 3 seg (pasos rápidos) |
Alcohol 80% | 3 seg (pasos rápidos) |
Alcohol 95% | 3 seg (pasos rápidos) |
Alcohol 95% | 3 seg (pasos rápidos) |
Deshidratante 100 % | 5min |
Deshidratante 100 % | 5min |
Sustituto de Xilol | 5min |
Sustituto de Xilol | 5min |
- Montaje
Como paso final son cubiertos con el cubreobjetos depositando previamente unas gotas de medio de montaje como bálsamo de Canadá, Eukitt, DPX, etc. Tras el montaje los preparados histológicos ya están disponibles para su observación microscópica.
Observación al microscopio.
- Melanoma 400x
- Hemangioma 400x
- Tricoepitelioma 10x
- 400x
Emisión de diagnósticos o resultados
Los resultados se emiten de 5 a 7 días que tarda todo el procedimiento técnico.
El diagnostico consta de la evaluación o descripción macroscópica, y microscópica, con el diagnóstico diferencial sugerido.
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